INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS PARA MUESTRAS CLÍNICAS:

Ajuste todas las configuraciones de umbral a 4000 unidades de fluorescencia. Según los parámetros de los canales FAM, VIC, TAMRA, ROX y CY5, después de ajustar los umbrales y las líneas de base, obtenga el resultado de la detección de cada canal. Todos los controles de prueba deben examinarse y cumplir con los valores preestablecidos antes de la interpretación de los resultados.

Tabla 7. Interpretación de resultados.

Interpretación de resultados	RD1 (FAM)	RD1 del (VIC)	RD9 (TAMRA)	TbD1 (ROX)	globina beta (CY5)
Tuberculosis	+	-	+	-	+/-
M. bovis de tipo salvaje	+	-	-	+	+/-
M. bovis BCG	-	+	-	+	+/-
M. tuberculosis y M. bovis de tipo salvaje	+	-	+	+	+/-
M. bovis de tipo salvaje y cepa M. bovis BCG	+	+	-	+	+/-
M. tuberculosis y M. bovis BCG	+	+	+	+	+/-
Resultado no válido	-	-	-	-	-
Resultado negativo	-	-	-	-	+
“+” representa un resultado positivo (Ct ≤ 40)
“-” representa un resultado negativo (Ct > 40)

AMPLIBIO, S.A. de C.V.

Calle 25 Núm. 91, Int. 1. Col. San Pedro de los Pinos

Benito Juárez, 03800, Ciudad de México, CDMX.

Tels.: 55 5337 1600/55 6677 8475

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LÍMITE PARA MUESTRAS CLÍNICAS:

Tabla 6. Valor límite de Ct.

Valor CT	Resultado
≤ 40	Detectado (+)
> 40 o N/A	No detectado (-)

PREPARACIÓN DE MASTERMIX DE AMPLIFICACIÓN POR PCR:

1. Prepare la mezcla maestra de amplificación por PCR de la siguiente manera según la proporción descrita en la tabla para reacciones (n+2):

Tabla 2. Preparación de la mezcla maestra de amplificación.

Contenido	Volumen (μL/rxn)
Mezcla de reacción de PCR I	12.5
Mezcla de reacción de PCR II	7.5
Volumen total de reactivo de amplificación	20

2. Dispense 20 μL de la mezcla maestra de amplificación por PCR recién preparada en cada pocillo. Guarde el reactivo restante a -20 ± 5 °C.

Agregar muestra:

1. Pipetee 5 μL de ADN extraído, muestra combinada o control positivo/negativo en los pocillos correspondientes. Registre el diseño de la muestra de placa.

2. Sellar la placa y centrifugar brevemente.

Amplificación por PCR:

1. Registre el volumen de reacción por pocillo como 25 1.

2. Configure el siguiente perfil y configuraciones de ciclo térmico para ABI 7500 y QuantStudio 5:

Tabla 3. Configuración de los parámetros del termociclador.

Paso	Temperatura	Tiempo	Ciclos
1	95 °C	2 minutos	1 ciclo
2	95 °C	10 segundos	45 ciclos
	60 °C	30 segundos (adquisición de fluorescencia)
	72 °C	10 segundos

Tabla 4. Configuración de los parámetros del termociclador.

Canal	Objetivo
FAM	RD1
VIC	RD1 del
TAMARA	RD9
ROX	TbD1
CY5	globina beta

CONTROL DE CALIDAD CRITERIOS DE VALIDACIÓN:

Control externo positivo y negativo:

Positivo: Las curvas de detección de los canales FAM, VIC, TAMRA y ROX deben tener un periodo de crecimiento logarítmico con un valor Ct ≤ 30.

Control negativo: El valor de Ct en los canales FAM, VIC, TAMRA, ROX y CY5 debe ser “Ninguno” o “N/A” sin una curva de amplificación significativa.

La prueba es válida cuando el control positivo, el control negativo y el control interno deben cumplir con los valores preestablecidos.

Tabla 5. Criterios de validación de controles externos.

Tipo de reacción	RD1 (FAM)	RD1 del (VIC)	RD9 (TAMRA)	TbD1 (ROX)	globina beta (CY5)
Control positivo	CT≤ 30	CT ≤ 30	CT ≤ 30	CT ≤ 30	-
Control negativo	-	-	-	-	-

EXTRACCIÓN DE ADN:

Importante: Las muestras de hisopos nasales y leche cruda requieren un tratamiento previo a la extracción de ADN. Las muestras de hisopos orales pueden requerir o no un tratamiento previo, según la calidad de la muestra.

1. Transfiera 800 1 de muestra a un tubo de 2 mL.

2. Centrifugar a 12.000 × g durante 10 minutos y desechar el sobrenadante.

3. Realice la extracción utilizando el kit de purificación de ácido nucleico MagMAX™ CORE (n.º de cat. A32702 o A32700) en el instrumento KingFisher Duo (n.º de cat. 5400110) o KingFisher Flex (n.º de cat. 5400610 o 5400630). Consulte las instrucciones del fabricante para obtener más información.

Agrupación de muestras (opcional):

1. Combine volúmenes iguales de hasta 5 muestras extraídas en un solo tubo. El volumen final de la muestra combinada debe ser de al menos 10 μL.

2. Mezcle la muestra preparada.

3. Guarde las muestras extraídas restantes.

MÉTODO DE RECOLECCIÓN DE MUESTRAS:

Hisopos orales/nasales: Recoja la muestra y sumerja el hisopo en un tubo estéril que contenga 2 mL de BHI, tioglicolato de sodio o medio de transporte Cary-Blair. Corte la parte que sobresale del eje del hisopo, si es necesario, para asegurar bien la tapa.

Leche entera cruda: Recoja un volumen mínimo de 5 mL de leche entera en un recipiente colector estéril.

Sangre pura: Recoja un volumen mínimo de 5 mL de sangre completa de la vena yugular, la vena coccígea o la vena mamaria en un tubo de extracción de sangre K2-EDTA de 5 mL y homogeneice invirtiendo suavemente el tubo (aproximadamente 6 veces).

Pretratamiento de muestra de hisopo nasal y (opcional) de hisopo oral:

Importante: Éste es un procedimiento opcional para hisopos orales, dependiendo de la calidad de la muestra. Puede utilizarse para tratar muestras con grandes cantidades de mucosa o poca claridad.

1. Centrifugar la muestra a 12 000 × g durante 10 minutos.

2. Deseche el sobrenadante.

3. Vuelva a suspender el precipitado con 0.5 mL de PBS.

4. Añadir 0.5 mL de NALC-NaOH al 2% y mezclar brevemente.

5. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

6. Centrifugar a 12 000 × g durante 10 minutos a 4 °C.

7. Deseche el sobrenadante.

8. Resuspender el precipitado con 1 mL de PBS.

Nota: Dependiendo del tamaño del pellet, el volumen máximo de PBS agregado no debe exceder los 2 mL.

Muestras de leche cruda:

1. Transfiera de 5 a 30 mL de la muestra de leche entera a un tubo limpio.

2. Centrifugar a 3 100 × g durante 30 minutos.

3. Retire con cuidado la fracción de suero.

4. Vuelva a suspender la crema restante y sedimente con 5 mL de PBS.

5. Añadir 5 mL de NALC-NaOH al 4% y mezclar brevemente.

6. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

7. Añadir 15 mL de PBS.

8. Centrifugar a 3 100 × g durante 30 minutos a 4 °C.

9. Deseche la fracción de suero.

10. Vuelva a suspender la crema restante y el sedimento con 1 mL de PBS.

Nota: Dependiendo del tamaño del pellet, el volumen máximo de PBS agregado no debe exceder los 2 mL.

Sangre pura: Continúe con 5 mL de sangre recogida en un tubo de sangre K2-EDTA de 5 mL.

CONTENIDO:

Tabla 1. Kit de detección BOVINE TRITB DETECTION, 384 reacciones (Cat# 6018026201-EN).

Nombre del componente	Descripción	Cantidad
TriTB bovina Mezcla de reacción de PCR I	Polimerasa taq	4 viales × 1 250 μL
TriTB bovina Mezcla de reacción de PCR II	Cebadores y sondas	4 viales × 750 μL
Control positivo de BOVINE TRITB DETECTION	ADN plasmídico no infeccioso que contiene las dianas: RD1, RD1 del, RD9 y TbD1 en tampón TE	2 viales × 480 μL
Control negativo de BOVINE TRITB DETECTION	Agua libre de nucleasas	2 viales × 480 μL

Nota: Los componentes del kit de diferentes lotes no son intercambiables.

Instrumentos de PCR aplicables:

• Sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems™ 7500.

• Applied Biosystems™ sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5.